Thursday, September 13, 2012

DIROFILARIA IMMITIS EN CHILE


Los hallazgos de microfilarias en frotis sanguíneos en este laboratorio, se han verificado en algunos pacientes caninos que provienen de países en donde esta parasitosis es endémica. No obstante, también fue diagnosticada mediante un hemograma solicitado a un canino callejero adoptado. Esta situación nos hace suponer que se trata de una enfermedad emergente en nuestro país, el que hasta la fecha ha sido considerado libre de dirofilariosis, siendo ésta de particular interés por su carácter zoonótico. Ante esto, consideramos relevante que los Médicos Veterinarios que atienden a carnívoros domésticos y de exhibición en los zoológicos, reconozcan los signos clínicos asociados a esta enfermedad; que la autoridad sanitaria disponga los sistemas de control para el ingreso al país de los animales hospedadores y difunda los protocolos de notificación epidemiológica para los casos confirmados. También es fundamental que los laboratorios clínicos veterinarios estandaricen los métodos de diagnóstico específico.




Se reproduce, a continuación, un resumen de la revisión bibliográfica publicada por la Dra. M. V. María Paz Muñoz Gajardo de la Universidad Austral de Chile. (Acceder al texto completo)



Dirofilaria immitis, es un nemátodo filaroídeo que provoca la “enfermedad del gusano del corazón”. Tiene una amplia distribución mundial, siendo endémica en todos los países de Sudamérica, excepto en Chile.

Es un nemátodo filiforme y cilíndrico, de color blanco, en sus formas adultas posee una cutícula con estriaciones transversales y longitudinales. Las hembras miden de 13,5 a 30 cm de largo y de 1 a 1,3 mm de diámetro. Los machos son de menor tamaño, miden 9,5 a 20 cm de largo, con 0,7 a 0,9 mm De diámetro. Su extremo posterior termina en espiral. Las microfilarias en promedio miden alrededor de 308μm de largo (con un rango de 295 a 325μm y 5 a 7,5μm de ancho, fusiformes, el extremo cefálico es ahusado y el extremo caudal puntiagudo y recto, no poseen vaina. Las microfilarias se encuentran todo el tiempo en la circulación periférica, pero para facilitar la transmisión, aumentan su concentración a la hora en que su vector se alimenta, a esta característica se llama periodicidad. Los mosquitos vectores pertenecen a la Familia Culicidae. Los culícidos son mosquitos pequeños, poco voluminosos y de patas largas (zancudos), vectores de la malaria, filarias y virus.

El principal hospedador definitivo y reservorio de la dirofilariosis, es el perro doméstico, pero también se incluyen cánidos salvajes como coyotes, lobos y zorros. Otros posibles huéspedes definitivos alternativos son el gato doméstico, mustélidos (hurones) y leones marinos de California, en los cuales hay desarrollo completo del parásito pero con una parasitación de baja intensidad y generalmente amicrofilarémica.

En algunos sectores de Chile, se dan las condiciones medioambientales y biológicas como para que se complete el ciclo de esta parasitosis y, por lo tanto, se puede considerar un país potencialmente en riesgo de infección. En los climas áridos del norte de Chile (I, II y III Región), se dan las condiciones de temperatura, pero no las de humedad. Sin embargo, las aguas estancadas en esas regiones semiáridas pueden permitir el desarrollo de las larvas de los mosquitos. En el norte chico (III, IV y V Región), la Región Metropolitana y la zona central (VI y VII Región) se dan las condiciones de temperatura y humedad durante gran parte del año o durante los meses de verano, lo que posibilitaría la sobrevivencia de vectores y el desarrollo del parásito.

A la fecha en Chile, no se han publicado trabajos sobre la existencia de un huésped intermediario que permita el desarrollo del parásito hasta su forma infectante. Sin embargo, el parásito podría adaptarse a los culícidos que sí están presentes, o eventualmente podría introducirse alguna de las setenta especies de mosquitos que actúan como hospedadores intermediarios y vectores biológicos de D. immitis.

Es de importancia que los Médicos Veterinarios chilenos tengan una mejor percepción de una parasitosis de índole mundial, que además es una zoonosis afortunadamente asintomática y, más aún, si existe la posibilidad que ingrese al país. Igualmente es trascendente que el profesional esté capacitado como para enfrentar una enfermedad emergente, saber controlarla y convertirla en un mal menor.

El diagnóstico de la infección en perros, se basa por lo general, en la identificación de microfilarias de D. immitis en una muestra de sangre o en la detección de antígenos del parásito adulto en sangre, suero o plasma, incluyendo siempre un examen físico.

La dirofilariosis podría sospecharse en perros de más de 2 años de edad que viven, o han vivido, en áreas endémicas, con alteraciones del aparato respiratorio como tos crónica, disnea de esfuerzo

o intolerancia al ejercicio, estertores, hemoptisis y alteraciones cardiovasculares como lipotimias o soplos cardiacos.

La identificación de microfilarias en sangre periférica, tiene una sensibilidad de 75% en animales que no están recibiendo tratamiento profiláctico con avermectinas.

Dentro de las técnicas de concentración habitualmente utilizadas para la detección de microfilarias se menciona la sedimentación mediante la técnica de Knott modificada y la filtración. Ambas técnicas de concentración son 50 a 90% más sensibles que el frotis sanguíneos directo. Sólo entre el 70 y el 80% de los perros infectados tienen microfilarias circulantes, por lo tanto, las pruebas de antígeno son muy superiores en la detección de parásitos adultos y son casi 100% específicos (es decir, prácticamente no hay ningún resultado falso positivo), por lo que deben utilizarse siempre como método screening de elección para la evaluación rutinaria.

Hematología: El hemograma es normal en la mayoría de perros con dirofilariosis clínica, puede presentarse un leucograma de estrés o una respuesta inflamatoria pronunciada, siendo habitual encontrar linfopenia entre leve y moderada. Las alteraciones hematológicas posibles de encontrar son:

• Anemia: alrededor de un 10% de los perros con dirofilariosis leve tiene anemia normocítica normocrómica. Entre el 50 y 60% de los perros con enfermedad grave presentan una ligera anemia no regenerativa normocítica hipocrómica, con un valor de hematocrito de 10 a 30%, excepto en animales con síndrome caval que presentan hemólisis. La vida media de los eritrocitos en perros asintomáticos es normal (25 días), pero se reduce a 15 días en perros con hipertensión pulmonar y a 11 días en animales con dirofilariosis grave.

• Eosinofilia: se encuentra en cerca del 85% de los perros con microfilarias circulantes y en el 95% de los perros amicrofilarémicos, debido a la destrucción de las microfilarias por la respuesta inmune.

• Basofilia: la dirofilariosis es la causa más habitual de basofilia en regiones endémicas. La basofilia junto con eosinofilia es un elemento sugerente aunque inespecífico de la enfermedad, pero en el 50% de los casos hay eosinofilia sin basofilia.

• Neutrofilia: generalmente hay aumento de la concentración de segmentados y monocitos y los recuentos plaquetarios decaen, en especial después del tratamiento adulticida. Los casos de leucocitosis son consecuencia del aumento de materiales extraños derivados de la fagocitosis de las filarias muertas y de las infecciones establecidas a nivel pulmonar, principalmente en las áreas lesionadas por tromboembolismo.

Perfil de coagulación: se altera significativamente en casos de tromboembolización grave, hay consumo activo de las plaquetas, fibrinógeno y otros substratos de la coagulación, pero la trombocitopenia relativa que se puede generar durante la enfermedad, se relaciona con el hecho que las plaquetas se adhieren a las superficies subendotelial lesionadas.

Bioquímica sanguínea: La concentración sérica de albúmina suele ser normal. La presencia de hipoalbuminemia es una situación crítica, ya que puede ser indicio de una glomerulopatía seria (amiloidosis o enfermedad por inmunocomplejos) indicativa de un daño renal progresivo irreversible, insuficiencia hepática grave o pérdida enterohepática de proteínas. Las complicaciones hepáticas y renales derivadas de la dirofilariosis pueden ser evaluadas con los perfiles bioquímicos respectivos.

Friday, August 17, 2012

TOXICOLOGIA VETERINARIA


El diagnóstico antemortem de las enfermedades toxicológicas, sobre la base de signos clínicos solamente a menudo es complejo y hasta peligroso. Cada sistema del organismo puede reaccionar de distinta forma, produciendo signos clínicos diversos frente a innumerables agentes tóxicos que pueden afectar a estos sistemas.
La enfermedades toxicológicas puede ser agudas o crónicas, y la presentación clínica variará dependiendo de la especie, de la vía involucrada, del agente y su magnitud; de la frecuencia de la exposición y del tiempo transcurrido desde esta exposición. Un diagnóstico toxicológico confirmado a menudo se basa en las conclusiones clínicas apropiadas. Entre ellas:
  • La historia de la exposición,
  • Los signos clínicos,
  • El tiempo de inicio,
  • La duración de los efectos en relación con el potencial tóxico del agente implicado,
  • La sustancia tóxica confirmada en el animal (por ejemplo, plomo en sangre),
  • La evidencia específica del trastorno fisiopatológico (por ejemplo, inhibición de la acetilcolinesterasa).
Incluso cuando un animal ya no puede beneficiarse de la confirmación positiva o negativa de laboratorio, esta información permite proteger a otros animales o a los seres humanos de las sustancias tóxicas evidenciadas.
Muchos antídotos específicos tienen una toxicidad inherente, y su uso a veces puede ser peligroso. Las 5 rutas básicas de la exposición a la intoxicación son:

1) la ingestión,
2) la absorción cutánea o tópica,
3) la inhalación, 4) la inyección o envenenamiento y
5) la absorción ocular.

La mayoría de las intoxicaciones resultan de la ingestión oral de una sustancia tóxica, pero algunos productos químicos incluyendo insecticidas, fenoles y otras sustancias lipofílicas, también pueden ser bien absorbidas a través la piel intacta. La piel erosionada puede absorber algunas sustancias que de otro modo podrían no llegar a concentraciones tóxicas después de la exposición dérmica. Por supuesto que muchos agentes con partículas volátiles, aerosoles, o incluso compuestos sólidos pueden ser absorbidos por el tracto respiratorio. Para la mayoría de los agentes, la velocidad de absorción de mayor a menor es:
  • Inyectable,
  • Respiratorio,
  • Oral,
  • Tópico.

El recorrido de la exposición a menudo influye en la elección de muestras para la confirmación. Además, de la toxicosis sistémica debido a la absorción sistémica de un agente, muchos otros compuestos corrosivos pueden dañar directamente el tejido. Los protocolos de toma de muestras toxicológicas en animales deben cosiderar los cuidados para evitar la contaminación cruzada de cualquier muestra de una potencial sustancia tóxica. Se recomienda obtener las muestras de los animales sospechosos antes de la manipulación del material de origen. Si es posible, antes de comenzar el tratamiento se deben obtener las muestras de sangre total con anticoagulante EDTA y luego congelar el plasma separado. Las muestras de vómitos, orina y heces son de gran utilidad para los análisis de laboratorio. Si no es posible recoger vómito, el lavado gástrico con agua es adecuado para el análisis. Los lavados o vómitos deben ser congelados en un frasco herméticamente cerrado. Si se sospecha de una exposición tópica, las muestras de pelo pueden ser congeladas en un recipiente químicamente limpio y sellado para el análisis.

Para el diagnóstico post-mortem la necropsia es fundamental para obtener un conjunto completo de muestras para los análisis químicos, histopatológicos y microbiológicos (bacteriano, viral, parasitario). Muchos diagnósticos toxicológicos se basan no sólo en la demostración de los residuos de la sustancia tóxica, sino también en las lesiones compatibles o en la ausencia de pruebas de otras enfermedades que causen efectos clínicos similares. Las muestras para análisis deben ser individuales, congeladas, en bolsas dobles o frascos plásticos herméticos, con rotulación clara. Los especímenes deben ser recogidos de manera sistemática: contenido gástrico o rumen, contenido intestinal, heces, tejido cerebral, hígado sin vesícula biliar, riñones, grasa corporal y orina. En caso de intoxicación a través de la piel, debe evitarse el contacto de este tejido con los órganos internos para evitar la contaminación cruzada. Se recomienda el lavado repetido o el reemplazo del material y los guantes utilizados después que las muestras de piel han sido tomadas. Iguales precauciones son necesarias cuando se sospecha de altas concentraciones de sustancias tóxicas en el tracto gastrointestinal o en los órganos para los análisis.
Para revisión completa acerca de toxicología veterinaria ingrese a este sitio.

Saturday, August 11, 2012

DIAGNOSTICO DE DISTEMPER. HEMATOLOGÍA Y BIOQUIMICA.


Los exámenes hematológicos y bioquímicos son inespecíficos. Sólo tienen valor para el monitoreo y el  pronóstico de la enfermedad.

Suele observarse anemia normocítica -normocrómica y regenerativa, la que puede incrementarse con el curso de la enfermedad.

La linfopenia absoluta ocurre por necrosis del dejido linfoide. Es dependiente de la edad y condición clínica del paciente, así como de la virulencia de la cepa viral.

Trombocitopenia moderada. También es dependiente de la edad, de la condición clínica de paciente y del genotipo viral.

Monocitosis relativa o absoluta es el cambio más constante en el leucograma.

Puede observarse leucocitosis neutrófila con o sin desviación a la izquierda, principalmente en cuadros con sobreinfección bacteriana.

Las proteínas totales generalmente son normales. Pueden aumentar en cuadros que cursan con deshidratación (↑ albúminas).

Las globulinas suelen estar aumentadas en pacientes inmunocompetentes.

En el FCE el diagnóstico puede hacerse si hay aumento de la proteinorraquia, pleocitosis linfocitaria, y son detectados anticuerpos específicos en una muestra no contaminada con sangre periférica.

Para revisar los métodos para diagnóstico de distemper mediante antígeno, pinche aquí.

Friday, August 10, 2012

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. DETECCIÓN DEL ANTIGENO VIRAL

La sensibilidad de estas pruebas es altamente dependiente de temporización del cuadro clínico.

Las partículas virales (antígenos) se pueden encontrar en los leucocitos, eritrocitos y células epiteliales tempranamente en el curso de la infección, a menudo antes de la aparición de los signos clínicos.

Luego de la aparición de estos signos, el antígeno CDV puede desaparecer de la sangre, conjuntiva y epitelio genital antes de una semana, detectándose por más tiempo en los macrófagos y en el epitelio del tracto respiratorio bajo.

La detección de antígenos virales de Distemper (acúmulos de cápsides intracitoplasmáticas) puede realizarse mediante métosdos serológicos o citológicos.


La Inmunocromatografía es un método similar a ELISA en su modalidad "sandwich". La reacción inunológica se realiza en una membrana cromatográfica por acción capilar. Se utilizan 2 tipos de anticuerpos contra el antígeno en estudio y uno para control positivo de la reacción.

Un anticuerpo está fijado en la membrana y el otro es un anticuepo marcado con oro coloidal infiltrado en la almoadilla que absorbe la muestra. Cuando la muestra líquida es colocada sobre esta almoadilla unida a la membrana, el antígeno de la muestra forma un inmunocomplejo con el anticuerpo marcado.
Este complejo migra en la fase líqida y se pone en contacto con el anticuerpo fijado en la membrana formando otro complejo que queda fijado en la membrana, formando una línea de color púrpura que denota la presencia del antígeno en una reacción positiva.
El excedente de antiecuerpos marcados con oro coloidal continua avanzando por capilaridad para unirse a los anticuerpos anti IgG fijados en el otro extremo de la membrana coloreándose como indicador de control de la reacción.

MICROSCOPÍA DE CUERPOS DE INCLUSIÓN CDV EN CÉLULAS SANGUÍNEAS Y CONJUNTIVALES.


Las inclusiones suelen ser fácilmente observadas enfrotis teñidos con Diff Quick.
La observación de la capa leucocitaria puede mejorar la probabilidad de encontrar estas células con inclusiones en sangre.
Dependiendo de los signos clínicos y de la etapa de la infección, las inclusiones intracitoplasmáticas se pueden encontrar en algunas células epiteliales de la conjuntiva, vejiga urinaria y en células del FCE.

Para revisar los métodos de diagnóstico mediante la determinación de anticuerpos pinche aquí.

Thursday, August 09, 2012

ANTICUERPOS ANTI DISTEMPER EN EL DIAGNÓSTICO.


El serodiagnostico, con determinación de anticuerpos IgM e IgG anti CDV, es el método diagnóstico más más solicitado al laboratorio. Si bien son pruebas confiables, es preciso una adecuada interpretación.
La medición de anticuerpos séricos IgM (contra las proteínas del núcleo viral NP y P) y los IgG (contra los antígenos de la cápsula H y F) ayudan al diagnóstico del Distemper, pero no es posible discriminar los anticuerpos pasivos maternos, los anticuerpos vacunales y los anticuerpos por infecciones subclínicas, de los que son producto de la enfermedad en cachorros, en animales previamente inmunizados o que han tenido contacto previamente con el virus.
Los de tipo IgM puede ser detectados en perros infectados no vacunados, entre los 6 y 8 días post infección. Los IgG aparecen entre los 10 y 20 días.
La pruebas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA, para la detección de IgM específica contra CDV, son pruebas útiles para el diagnóstico, ya que IgM persiste en perros infectados 1 a3 meses, dependiendo de la cepa viral y de la respuesta del huésped.
En perros vacunados la IgM persiste por unas 3-4 semanas. Falsos negativos pueden observarse en perros que mueren en forma aguda, sin la presencia de respuesta inmunitaria, y puede darse además, en presentaciones subagudas o crónicas.
Los títulos seriados de IgG determinados en 2 muestras con 2 semanas de diferencia, son de valor en perros que no han sido vacunados dentro del mes anterior. Un aumento de cuatro veces o mas, entre la etapa de la fase aguda y la convaleciente, es señal de una enfermedad activa.
Los títulos de anticuerpos en muestras de FCE, mayores que los del suero, se atribuyen a una infección activa, puesto que esos anticuerpos se han producido localmente.

Para revisar el método de inmunofluorescencia indirecta (IFA) para diagnosticar distemper, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFA).

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFA).




Es un método de alta sensibilidad, especificidad  y valor diagnóstico, aunque su calidad es dependiente de la experiencia del microscopista.
El suero o FCE canino diluido se incuba en los pocillos  individuales de un portaobjeto que contiene una mezcla de células (fibroblastos) infectadas con antígenos de CDV, junto a células no infectadas.
Luego se agrega un conjugado que contiene anticuerpos anti-IgM o anti-IgG marcados con fluoresceina, los cuales se unen al complejo Ag-Ac previanente  formado.
El resultado de la reacción se visualiza en un microscopio de fluorescencia en que la reacción positiva se aprecia con la emisión fluorescente color verde manzana desde la superficie de las células infectadas.
Los resultados positivos pueden ser re-testeados con diluciones mayores, para determinar el título reactivo máximo de la muestra.

Para revisar el diagnóstico de distemper mediante el método inmunoenzimático, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA).

IMMUNOCOMB

Es un método rápido, de baja complejidad  y niveles intermedios de sensibilidad y especificidad para la determinación de anticuerpos anti-CDV en sangre y FCE
Es un ensayo inmunoenzimático indirecto. La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas:

Punto superior — inmunoglobulina canina (Control Interno).
Punto inferior — antígeno estructural de CDV
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo, pasando el peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa.

La reacción coloreada positiva en la fase sólida puede cuantificarse, comparando la intensidad del color de la reacción en una escala cromática incluida en el kit (Comb Scale) e interpolando en el gráfico adjunto para estimar los títulos de anticuerpos anti-CDV.

Para revisar la virología del virus distemper, pinche aquí.

VIROLOGÍA DEL VIRUS DISTEMPER CDV

El Distemper canino es causado por un Morbillivirus perteneciente a la familia Paramyxo-viridae estructuralmente relacionado con el virus Sarampión .
El virus tiene una envoltura de RNA en una cadena de polaridad negativa y se considera un serotipo único, con cepas que varían en su tropismo y virulencia.
La  secuencia de sus genes (hemaglutinina, neuraminidasa, proteína de fusión), sugieren que existen diferencias en los genotipos, condición que es de importancia para el diagnóstico molecular y para la elaboración de vacunas.

El virus se une a los receptores de la superficie celular de la célula huésped a través de la glicoproteína H (hemaglutinina).
Se fusiona con la membrana plasmática y el RNA de la cápside, para liberarse posteriormente en el citoplasma.

La replicación se inicia cuando la nucleoproteína está en cantidad suficiente para la neo-sintetisis de antigenomas y genomas virales.
El  RNA de la cápside interactúa con la proteína de la matriz debajo de la membrana plasmática y de las yemas para la posterior liberación del virión.

Para revisar  el diagnóstico molecular del distemper, pinche aquí.

DISTEMPER. DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR RT-PCR



Los métodos antes revisados para el diagnóstico ante-mortem de distemper  son altamente dependientes del estadío de la infección, de la condición clínica del paciente y no siempre cumplen con los requerimientos de sensibilidad y especificidad.

Los recientes desarrollos de las técnicas de biología molecular revelan la utilidad de estos métodos con propósitos diagnósticos, como también para estudios patológicos y epidemiológicos.

La Reación de la Plolimerasa en Cadena por transcripción reversa (RT-PCR) para la detección del RNA viral del CDV representa un método diagnóstico antemortem, altamente sensible y específico, temprano y seguro, utilizando muestras de sangre, suero y fluído cerebroespinal, independiente de los hallazgos clínicos, histopatológicos; de los títulos de anticuerpos  y de la distribución del antígeno viral, en casos agudos y crónicos.

La RT-PCR como prueba diagnóstica es capaz de amplificar fragmentos del ácidos nucleicos en forma exponencial, aún encontrándose en la muestra una sola molécula, indetectable por otros métodos, logrando determinar la infección desde el segundo día de iniciada.

Generalmente se amplifican fragmentos del gen que codifica la nucleoproteina (NP), una región conservada dentro del genoma viral. Además, puede aplicarse al estudio de variaciones genéticas del virus, mediante caracterización molecular de secuencias claves del genoma.

Este virus también ha sido detectado en la sangre de los cachorros clínicamente normales hasta 10 días después de la vacunación con vacunas de virus atenuados, por lo que se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados de estos pacientes.

La sensibilidad del método depende de la muestra utilizada, de la técnica de recogida, del estadio de la enfermedad, del método de extracción de ácidos nucleicos, de los cebadores (partidores o primers) y del método de PCR. Se mejora aún más la sensibilidad analítica si se utiliza la capa leucocitaria para la extracción de RNA.

Wednesday, August 08, 2012

DIAGNOSTICO DE DISTEMPER POR RT-PCR. DISEÑO DE PRIMERS

Un primer (partidor, cebador, iniciador), es una cadena de ácido nucleico que sirve como punto de partida para la replicación del DNA.

Es una secuencia corta que contiene un grupo 3'hidroxilo libre, que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra.

La secuencia y posición de los nucleótidos que conforman el primer se relaciona directamente con la especificidad del fragmento de DNA que se intenta replicar.

Se necesitan dos primers para la reacción de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra y se componen de aproximadamente 20 nucleótidos.


FUENTE:  J Clin Microbiol. 1999 November; 37(11): 3634–3643.
Copyright © 1999, American Society for Microbiology
Detection of Canine Distemper Virus Nucleoprotein RNA by Reverse Transcription-PCR Using Serum, Whole Blood, and Cerebrospinal Fluid from Dogs with Distemper.

DIEGNÓSTICO DE DISTEMPER POR RT-PCR. EXTRACCIÓN DEL RNA


El mRNA purificado de la muestra es utilizado posteriormente para la síntesis de la primera cadena de cDNA mediante Transcripción Reversa. En este proceso intevienen el RNA aislado (molde), la enzima Transcriptasa Reversa (de leucemia murina), cebadores de DNA, RNAasa, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y buffers.
El primer 1 se une a la cadena de RNA, y mediante la actividad de la Transcriptasa Reversa se extiende una cadena cDNA, resultando una molécula híbrida. A continuación, mediante la actividad de la enzima RNAasa H, se degrada el RNA viral que fué utilizado como molde.
El primer 2 se une al cDNA monocatenario para sintetizar la hebra complementaria y se procede a la correspondiente elongación mediante la actividad de la DNA polimerasa.
La amplificación del DNA que se ha sintetizado, se consigue mezclándolo con los primers de complentaridad específica al extremo 3´ del DNA, los cuales actuan como iniciadores para la actividad de la polimerasa. En esta solución deben también estar presentes los dNTPs que son las unidades que componene el DNA, en una mezcla equimolar, y la TAq polimerada (enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus).
Esta síntesis exponencial de DNA por RT-PCR incluye 3 pasos:
  • Desnaturalización o separación de las hebras del DNA (94°C x 1,0 min)
  • Alineamiento o apareamiento de los primers a la región complementaria del DNA (59,5°C x 2,0 min).
  • Extensión o síntesis del nuevo DNA idéntico, mediante la actividad de la polimerasa (72°C x 1,0 min).
Estos pasos se repiten automáticamente unas 40 veces en un termociclador, para crear millones de copias del fragmento del DNA, derivado de la transcipción del RNA del virus distemper.






Tuesday, August 07, 2012

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. RT-PCR ELECTROFORESIS



  • El resultado del DNA amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, previamente cargado con muestras y controles, bajo un campo eléctrico de 60v durante 15 min. El gel luego es teñido con Bromuro de Etidio y se observa y fotografía en un visualizador de electroforetograma.
  • Los canales electroforéticos son cargados con un control negativo (muestra libre de DNA), un control positivo (muestra con antígeno viral confirmado), marcadores de peso molecular y los productos PCR de cada muestra analizada. El resultado de esta PCR convencional es expresado en forma cualitativa (positivo o negativo).
  • Está previamente definido que el DNA transcrito del RNA del CCV migra a una distancia equivalente a 287 pb. Confirmación que se hace por comparación con el marcador de peso molecular desplegado en el elecroforetograma.

Sunday, February 20, 2011

INSUFICIENCIA PANCREÁTICA EXOCRINA (EPI) EN PERROS

FISIOLOGÍA: El páncreas secreta una importante batería de enzimas, que en conjunto tienen la capacidad de reducir prácticamente todas las macromoléculas digeribles para permitir su absorción por el intestino. El tripsinógeno y el quimotripsinógeno se liberan al lumen del intestino delgado, donde se transforman en sus formas activas para la digestión de proteínas. El tripsinógeno es activado por la enzima enteroquinasa que está en la mucosa intestinal. La tripsina, a su vez, activa al quimotripsinógeno y a las moléculas análogas del tripsinógeno. El resultado neto es una actividad explosiva de las proteasas liberadas a las secreciones pancreáticas que llegan al intestino delgado. Tripsina y quimotripsina reducen las proteínas en péptidos medianos pequeños, pero no pueden digerir las proteínas y péptidos a aminoácidos individuales. Otras proteasas del páncreas, como la carboxipeptidasa, tienen esta capacidad, aunque la digestión final de los péptidos en aminoácidos es principalmente realizada por las peptidasas de las células epiteliales superficiales del intestino delgado.

FISIOPATOLOGÍA: EPI (Exocrine Pancreatic Insufficiency), o Insuficiencia Pancreática Exocrina, es una patología que se manifiesta por la incapacidad de las células acinares del páncreas exocrino para producir y secretar los 3 sistemas enzimáticos necesarios para la digestión de los alimentos: La amilasa para la digestión de los carbohidratos (azúcares y almidones de cereales, frutas y hortalizas); Las lipasas para la digestión de las grasas y aceites; La tripsina y proteasas para la digestión de las proteínas. EPI es referida a veces como una hipoplasia del páncreas o del tejido acinar. También puede ser una condición secundaria a una enfermedad crónica, como la pancreatitis crónica. Sin la actividad de estas enzimas, el resultado es una malabsorción con presencia de restos de alimentos sin digerir en las deposiciones del perro, el que si bien ingiere gran cantidad de alimentos, está permanentemente desnutrido. Sin un tratamiento adecuado, el paciente puede literalmente morir de hambre y desnutrición. Con EPI, los órganos inmunológicos, nerviosos y todos los otros sistemas del organismo pueden verse comprometidos en distintos grados. La falta de nutrientes generalmente provoca cambios el temperamento del animal, lo que puede expresarse como miedo y/o agresión. EPI es una enfermedad devastadora y a menudo mal diagnosticada. Los síntomas suelen no aparecer sino hasta que el 80% a 95% de las células acinares están dañadas. Además no todos los perros muestran una evolución clara de signos y síntomas y es una enfermedad que afecta a todas las razas.

SIGNOS Y SÍNTOMAS. Los más comunes son:

• Gradual enflaquecimiento a pesar de un apetito voraz.
• Defecar con mucha frecuencia, a veces cada media hora.
• Deposición grasa (esteatorrea), amarillenta o grisásea, voluminosa.
• Comer sus propias heces (coprofagia) u otras sustancias inapropiadas
• Aumento de los ruidos abdominales
• Aumento de la flatulencia y vómitos ocasionales.

Saturday, February 19, 2011

DIAGNÓSTICO DE INSUFICIENCIA PANCREÁTICA EXOCRINA (EPI) MEDIANTE TLI EN PERROS.


La atrofia severa del páncreas exocrino es la causa más común de EPI y se presenta con hallazgos patológicos típicos: tejido delgado y transparente a través del cual se observan las estructuras glandulares anormales. Para el diagnóstico de EPI se han utilizado métodos indirectos, como la detección de alimentos no digeridos en las heces; la determinación de la actividad fecal de enzimas proteolíticas (tripsina fecal); la prueba de tolerancia al almidón y la evaluación de la absorción grasa. No obstante, estas pruebas son poco sensibles o específicas. El análisis de la actividad de las enzimas pancreáticas en el líquido intestinal, tras la administración oral del substrato de quimotripsina bentiromida (ácido N-benzoil-Lp-aminobenzoico: BT-P ABA) es un método confiable, pero es una prueba extensa e invasiva.
Las células acinares pancreáticas producen las enzimas digestivas que son secretadas hacia el duodeno como zimógenos inactivos. Estos zimógenos pancreáticos (tripsinógeno, quimiotripsinógeno y análogos) son constituyentes sanguíneos normales y se encuentran en cantidades trazables en el suero, y reaccionan en conjunto con anticuerpos monoclonales, recibiendo la denominación de TLI (Trypsin Like Immunoreactivity). Estos zimógenos son producidos y almacenados sólo en las células acinares pancreáticas, por lo que la TLI es un marcador órgano específico. Este fundamento ha permitido desarrollar métodos de análisis efectivos para el diagnóstico de EPI canina, como el el ensayo inmunoenzimático quimioluminiscente en fase sólida utilizado en nuestro laboratorio (Immulite Canine TLI ®).

Se ha confirmado que la TLI se eleva en la sangre después de las comidas, aunque estos valores suelen ser menores al límite superior del rango de referencia. No obstante, en pacientes con una pérdida moderada del tejido acinar pancreático, estos aumentos transitorios pueden interpretarse como normales en pacientes con EPI incipiente. Por esta razón, se requiere ayuno estricto de 6 a 8 horas previo a la toma de muestra para el análisis.
Si bien la vida media de la TLI en la circulación es corta (menos de 20 minutos), es muy estable en el suero o el plasma, hasta 7 días de almacenamiento con refrigeración. En el suero no se ve afectada por la congelación prolongada a -20°C. La medición cuantitativa de TLI es confiable para diferenciar del EPI de otras causas de malabsorción, como la enfermedad del intestino delgado. Una vez diagnosticada la EPI, la TLI puede servir de control o monitoreo efectivo en perros y gatos que están en tratamiento de suplementación con enzimas pancreáticas.
En pancreatitis, el diagnóstico mediante la TLI tiene un enfoque distinto, puesto que su elevación por sobre el valor de referencia ocurre en los 2-3 primeros días de evolución, siendo de utilidad en el diagnóstico precoz de la enfermedad y es fundamental para el pronóstico. Se recomienda usar TLI en conjunto con otras pruebs pancreáticas (lipasa y amilasa), lo que ayuda a precisar el diagnóstico.
Los perros sanos tienen una concentración sérica de TLI de 5,0 a 35,0 ng/ml, mientras. que los perros con EPI en fase terminal, tienen niveles anormalmente bajos (<>

Sunday, September 19, 2010

HIPERTIROIDISMO FELINO. INTRODUCCIÓN



David B. Church, BVSc, PhD, MACVSc, MRCVs, ILTM

Traducción: Alejandro Flores A. VetLab

En contraste con el perro, cuya enfermedad tiroídea más común es el hipotiroidismo, para el gato la enfermedad de la glándula tiroides más frecuente es el hipertiroidismo o tirotoxicosis.
Desde los primeros informes clínicos de la tirotoxicosis felina, en 1979, esta condición ha sido reconocida con una frecuencia creciente. La explicación de este aumento en la prevalencia sigue siendo incierta, pero parece poco probable que se deba únicamente a un mayor reconocimiento o al aumento en la expectativa de vida del gato doméstico. Cualesquiera sean las razones, parece ser que éstas sólo influyen en los felinos y no a la población canina, porque la tirotoxicosis sigue siendo un trastorno muy poco común en los perros. El hipertiroidismo felino resulta del desarrollo espontáneo de los nódulos de una glándula tiroides hiperfuncional, y no está necesariamente asociada con una neoplasia tiroídea maligna. Un problema similar se presenta en humanos, bajo el nombre de “bocio nodular tóxico ". Aunque existen algunas similitudes entre la enfermedad en el hombre y la de los gatos, también existen algunas diferencias significativas. La glándula tiroides del gato hipertiroídeo contiene uno o varios nódulos grandes de funcionamiento autónomo. Al parecer, ni el crecimiento ni la hiperfunción de estos nódulos depende de estimuladores extratiroídeos circulantes. La lesión de base parece ser una excesiva capacidad de crecimiento intrínseco de algunas células.

HIPERTIROIDISMO FELINO. FACTORES DE RIESGO

Los factores de riesgo propuestos para el desarrollo de hipertiroidismo felino incluyen a los gatos alimentados con productos enlatados o el uso de arena para sus deposiciones. Los factores ambientales, como la exposición a compuestos goitrogénicos (que inhiben la iodinización de la tiroxina) como los ftalatos, también han sido descritos. Los gatos tienen una capacidad relativamente lenta de la glucuronidación, cual es la vía metabólica responsable del catabolismo de muchos compuestos goitrogénicos. Tambien se ha sugerido como factor de riesgo los autoanticuerpos y las causas genéticas o infecciosas.

HIPERTIROIDISMO FELINO. CARACTERISTICAS CLINICAS



Ésta es básicamente una enfermedad de aparición en gatos de edad mediana o mayores. En un estudio reciente el 90% de los gatos afectados tenía 11 años de edad o más. El signo más frecuente es la pérdida significativa de peso. A menudo acompañado de polidipsia, aumento o disminución del apetito y vómitos ocasionales. En algunos casos, se asocia el aumento del volumen fecal o incluso diarrea. Los animales afectados pueden ser hiperactivos o agresivos, alternativamente, o pueden padecer letargia y escasa respuesta a los estímulos.
Aunque los signos de insuficiencia cardíaca congestiva no son comunes, en muchos gatos afectados por un hipertiroidismo leve a moderado, aparece miocardiopatía hipertrófica, la que generalmente provoca un aumento del gasto cardíaco, con o sin un soplo sistólico, el que es más audible sobre la base del corazón.
Puede palparse una masa tiroidea discreta hasta en un 90% de los casos afectados, pero hay que recordar que muchos gatos mayores pueden tener nódulos tiroideos palpables que son clínicamente insignificantes, mientras que no todos los gatos con hipertiroidismo tienen una lesión palpable.
Patología Clínica de Rutina: En el hemograma se pueden observar cambios inespecíficos, los que pueden incluir eritrocitosis y un leucograma de estrés. Puede haber una elevación leve a marcada de la alanina aminotransferasa (ALT), aspartato aminotransferasa (AST) y fosfatasa alcalina (ALP), que son las alteraciones bioquímicas más frecuentes en esta patología. Los análisis de varias series de casos clínicos sugieren que aproximadamente el 90% de los gatos hipertiroídeos tienen una elevación en una de estas tres enzimas. Sin embargo, esto no quiere decir que la ausencia de la elevación de estas enzimas se oponga al diagnóstico de hipertiroidismo.
También pueden encontrarse leves a moderados aumentos en la urea y la creatinina en más del 25% de los gatos con hipertiroidismo, mientras que la hiperfosfatemia, sin azoemia, se puede encontrar hasta en el 20% de ellos.

HIPERTIROIDISMO FELINO. TEST HORMONALES

Elevaciones en las concentraciones basales de T4 plasmática son patognomónicas de la tirotoxicosis en un gato mayor, aunque un T4 plasmático normal no excluye el diagnóstico. Tanto el T4 plasmático total y el T4 libre pueden fluctuar dentro del rango normal en los gatos hipertiroídeos durante un período de algunos días.
Por otra parte, cualquier complicación estresante tenderá a bajar los niveles de T4 basales, resultando que en un gato evidentemente hipertiroídeo presente niveles basales de T4 dentro del rango normal.
En consecuencia, existe una serie de razones por las que un animal puede tener todas las características clínicas de hipertiroidismo, pero no tienen una T4 basal elevada. En estos casos, donde hay una fuerte impresión clínica de hipertiroidismo y una TT4 basal no confirmatoria, hay algunas alternativas que pueden ser consideradas.
En primer lugar, puede ser prudente esperar simplemente por un mes más o menos y repetir la prueba TT4 basal, después de comunicarle al dueño que si el gato es efectivamente hipertiroideo, existe la posibilidad de deterioro agudo en cualquier momento.
La determinación de T4 libre por diálisis de equilibrio (edFT4) puede ser aclaratoria en algunos casos, puesto que se ha informado que hay gatos hipertiroideos con la TT4 basal normal que tienen niveles elevados de edFT4. Desafortunadamente, en algunos gatos no hipertitoídeos, puede haber una elevación de dFT4, por lo que no es prudente usar el ensayo edFT4 como prueba de detección de hipertiroidismo
Una serie de informes también demuestran que la gammagrafía puede ser útil en la determinación de los pacientes hipertiroídeos, ya que en casi todos se presenta una recaptación asimétrica excesiva. Desafortunadamente la precisión de la centellografía por escaneo es muy dependiente del operador y de los equipos. Toda evaluación de la gammagrafía tiroidea felina requiere de la interpretación de un especialista, haciendo de ésta una alternativa a disposición de unos pocos.
Una alternativa válida puede ser una prueba funcional de la actividad tiroidea. El método funcional más confiable para descartar absolutamente el hipertiroidismo es una prueba de supresión con T3.
La prueba de supresión con T3 utiliza el efecto supresor de los niveles elevados de T3 plasmáticos sobre la TSH. Una disminución de la producción de TSH se traducirá en una reducción significativa de la síntesis endógena de T3 y T4 y en la secreción del tejido tiroídeo normal. Como el hipertiroidismo felino es causado por un tejido tiroídeo funcional autónomo, la administración de T3 a los animales hipertiroídeos no produce una disminución significativa en el plasma los niveles de T4.
El examen se realiza determinando los niveles plasmáticos de T4 total antes y después de la administración de T3 por vía oral. Dosis de 25 ug de T3 se administran cada 8 horas durante dos días y una dosis final en la mañana del tercer día (con un total de 7 dosis y una administración total de 175 ug). Se le toma una muestra basal antes de la prueba y una 8 horas después la última dosis para la determinación de TT4.
Aunque hay varias formas de interpretar la prueba de supresión con T3, lo más simple y sensible es comparar antes y después los valores absolutos de TT4 . Después de la administración de T3 los valores plasmáticos de TT4 son menores de 20 nmol/L en los gatos que no tienen hipertiroidismo, mientras que los gatos hipertiroídeos presentan valores de TT4 superiores a 20 nmol/L.
Actualmente la forma farmacéutica de T3 sólo está disponible como comprimidos de Tertroxin(R) 20 mg . Como la principal limitación para esta prueba es la incógnita de si el gato en realidad recibió las dosis correspondientes, hay que destacar a los propietarios que su gato debe recibir un comprimido más un cuarto tres veces al día. Aunque hay una tendencia a poner los comprimidos en la comida, esto es poco confiable.