TOXICOLOGIA VETERINARIA

El diagnóstico antemortem de las enfermedades toxicológicas, sobre la base de signos clínicos solamente a menudo es complejo y hasta peligroso. Cada sistema del organismo puede reaccionar de distinta forma, produciendo signos clínicos diversos frente a innumerables agentes tóxicos que pueden afectar a estos sistemas.

La enfermedades toxicológicas puede ser agudas o crónicas, y la presentación clínica variará dependiendo de la especie, de la vía involucrada, del agente y su magnitud; de la frecuencia de la exposición y del tiempo transcurrido desde esta exposición. Un diagnóstico toxicológico confirmado a menudo se basa en las conclusiones clínicas apropiadas. Entre ellas:

• La historia de la exposición,
• Los signos clínicos,
• El tiempo de inicio,
• La duración de los efectos en relación con el potencial tóxico del agente implicado,
• La sustancia tóxica confirmada en el animal (por ejemplo, plomo en sangre),
• La evidencia específica del trastorno fisiopatológico (por ejemplo, inhibición de la acetilcolinesterasa).

Incluso cuando un animal ya no puede beneficiarse de la confirmación positiva o negativa de laboratorio, esta información permite proteger a otros animales o a los seres humanos de las sustancias tóxicas evidenciadas.

Muchos antídotos específicos tienen una toxicidad inherente, y su uso a veces puede ser peligroso. Las 5 rutas básicas de la exposición a la intoxicación son:

1) la ingestión,

2) la absorción cutánea o tópica,

3) la inhalación, 4) la inyección o envenenamiento y

5) la absorción ocular.

La mayoría de las intoxicaciones resultan de la ingestión oral de una sustancia tóxica, pero algunos productos químicos incluyendo insecticidas, fenoles y otras sustancias lipofílicas, también pueden ser bien absorbidas a través la piel intacta. La piel erosionada puede absorber algunas sustancias que de otro modo podrían no llegar a concentraciones tóxicas después de la exposición dérmica. Por supuesto que muchos agentes con partículas volátiles, aerosoles, o incluso compuestos sólidos pueden ser absorbidos por el tracto respiratorio. Para la mayoría de los agentes, la velocidad de absorción de mayor a menor es:

• Inyectable,
• Respiratorio,
• Oral,
• Tópico.

El recorrido de la exposición a menudo influye en la elección de muestras para la confirmación. Además, de la toxicosis sistémica debido a la absorción sistémica de un agente, muchos otros compuestos corrosivos pueden dañar directamente el tejido. Los protocolos de toma de muestras toxicológicas en animales deben cosiderar los cuidados para evitar la contaminación cruzada de cualquier muestra de una potencial sustancia tóxica. Se recomienda obtener las muestras de los animales sospechosos antes de la manipulación del material de origen. Si es posible, antes de comenzar el tratamiento se deben obtener las muestras de sangre total con anticoagulante EDTA y luego congelar el plasma separado. Las muestras de vómitos, orina y heces son de gran utilidad para los análisis de laboratorio. Si no es posible recoger vómito, el lavado gástrico con agua es adecuado para el análisis. Los lavados o vómitos deben ser congelados en un frasco herméticamente cerrado. Si se sospecha de una exposición tópica, las muestras de pelo pueden ser congeladas en un recipiente químicamente limpio y sellado para el análisis.

Para el diagnóstico post-mortem la necropsia es fundamental para obtener un conjunto completo de muestras para los análisis químicos, histopatológicos y microbiológicos (bacteriano, viral, parasitario). Muchos diagnósticos toxicológicos se basan no sólo en la demostración de los residuos de la sustancia tóxica, sino también en las lesiones compatibles o en la ausencia de pruebas de otras enfermedades que causen efectos clínicos similares. Las muestras para análisis deben ser individuales, congeladas, en bolsas dobles o frascos plásticos herméticos, con rotulación clara. Los especímenes deben ser recogidos de manera sistemática: contenido gástrico o rumen, contenido intestinal, heces, tejido cerebral, hígado sin vesícula biliar, riñones, grasa corporal y orina. En caso de intoxicación a través de la piel, debe evitarse el contacto de este tejido con los órganos internos para evitar la contaminación cruzada. Se recomienda el lavado repetido o el reemplazo del material y los guantes utilizados después que las muestras de piel han sido tomadas. Iguales precauciones son necesarias cuando se sospecha de altas concentraciones de sustancias tóxicas en el tracto gastrointestinal o en los órganos para los análisis.

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DIAGNOSTICO DE DISTEMPER. HEMATOLOGÍA Y BIOQUIMICA.

Los exámenes hematológicos y bioquímicos son inespecíficos. Sólo tienen valor para el monitoreo y el  pronóstico de la enfermedad.

Suele observarse anemia normocítica -normocrómica y regenerativa, la que puede incrementarse con el curso de la enfermedad.

La linfopenia absoluta ocurre por necrosis del dejido linfoide. Es dependiente de la edad y condición clínica del paciente, así como de la virulencia de la cepa viral.

Trombocitopenia moderada. También es dependiente de la edad, de la condición clínica de paciente y del genotipo viral.

Monocitosis relativa o absoluta es el cambio más constante en el leucograma.

Puede observarse leucocitosis neutrófila con o sin desviación a la izquierda, principalmente en cuadros con sobreinfección bacteriana.

Las proteínas totales generalmente son normales. Pueden aumentar en cuadros que cursan con deshidratación (↑ albúminas).

Las globulinas suelen estar aumentadas en pacientes inmunocompetentes.

En el FCE el diagnóstico puede hacerse si hay aumento de la proteinorraquia, pleocitosis linfocitaria, y son detectados anticuerpos específicos en una muestra no contaminada con sangre periférica.

Para revisar los métodos para diagnóstico de distemper mediante antígeno, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. DETECCIÓN DEL ANTIGENO VIRAL

La sensibilidad de estas pruebas es altamente dependiente de temporización del cuadro clínico.

Las partículas virales (antígenos) se pueden encontrar en los leucocitos, eritrocitos y células epiteliales tempranamente en el curso de la infección, a menudo antes de la aparición de los signos clínicos.

Luego de la aparición de estos signos, el antígeno CDV puede desaparecer de la sangre, conjuntiva y epitelio genital antes de una semana, detectándose por más tiempo en los macrófagos y en el epitelio del tracto respiratorio bajo.

La detección de antígenos virales de Distemper (acúmulos de cápsides intracitoplasmáticas) puede realizarse mediante métosdos serológicos o citológicos.

La Inmunocromatografía es un método similar a ELISA en su modalidad "sandwich". La reacción inunológica se realiza en una membrana cromatográfica por acción capilar. Se utilizan 2 tipos de anticuerpos contra el antígeno en estudio y uno para control positivo de la reacción.

Un anticuerpo está fijado en la membrana y el otro es un anticuepo marcado con oro coloidal infiltrado en la almoadilla que absorbe la muestra. Cuando la muestra líquida es colocada sobre esta almoadilla unida a la membrana, el antígeno de la muestra forma un inmunocomplejo con el anticuerpo marcado.

Este complejo migra en la fase líqida y se pone en contacto con el anticuerpo fijado en la membrana formando otro complejo que queda fijado en la membrana, formando una línea de color púrpura que denota la presencia del antígeno en una reacción positiva.

El excedente de antiecuerpos marcados con oro coloidal continua avanzando por capilaridad para unirse a los anticuerpos anti IgG fijados en el otro extremo de la membrana coloreándose como indicador de control de la reacción.

MICROSCOPÍA DE CUERPOS DE INCLUSIÓN CDV EN CÉLULAS SANGUÍNEAS Y CONJUNTIVALES.

Las inclusiones suelen ser fácilmente observadas enfrotis teñidos con Diff Quick.

La observación de la capa leucocitaria puede mejorar la probabilidad de encontrar estas células con inclusiones en sangre.

Dependiendo de los signos clínicos y de la etapa de la infección, las inclusiones intracitoplasmáticas se pueden encontrar en algunas células epiteliales de la conjuntiva, vejiga urinaria y en células del FCE.

Para revisar los métodos de diagnóstico mediante la determinación de anticuerpos pinche aquí.

ANTICUERPOS ANTI DISTEMPER EN EL DIAGNÓSTICO.

El serodiagnostico, con determinación de anticuerpos IgM e IgG anti CDV, es el método diagnóstico más más solicitado al laboratorio. Si bien son pruebas confiables, es preciso una adecuada interpretación.

La medición de anticuerpos séricos IgM (contra las proteínas del núcleo viral NP y P) y los IgG (contra los antígenos de la cápsula H y F) ayudan al diagnóstico del Distemper, pero no es posible discriminar los anticuerpos pasivos maternos, los anticuerpos vacunales y los anticuerpos por infecciones subclínicas, de los que son producto de la enfermedad en cachorros, en animales previamente inmunizados o que han tenido contacto previamente con el virus.

Los de tipo IgM puede ser detectados en perros infectados no vacunados, entre los 6 y 8 días post infección. Los IgG aparecen entre los 10 y 20 días.

La pruebas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA, para la detección de IgM específica contra CDV, son pruebas útiles para el diagnóstico, ya que IgM persiste en perros infectados 1 a3 meses, dependiendo de la cepa viral y de la respuesta del huésped.

En perros vacunados la IgM persiste por unas 3-4 semanas. Falsos negativos pueden observarse en perros que mueren en forma aguda, sin la presencia de respuesta inmunitaria, y puede darse además, en presentaciones subagudas o crónicas.

Los títulos seriados de IgG determinados en 2 muestras con 2 semanas de diferencia, son de valor en perros que no han sido vacunados dentro del mes anterior. Un aumento de cuatro veces o mas, entre la etapa de la fase aguda y la convaleciente, es señal de una enfermedad activa.

Los títulos de anticuerpos en muestras de FCE, mayores que los del suero, se atribuyen a una infección activa, puesto que esos anticuerpos se han producido localmente.

Para revisar el método de inmunofluorescencia indirecta (IFA) para diagnosticar distemper, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFA).

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFA).

Es un método de alta sensibilidad, especificidad  y valor diagnóstico, aunque su calidad es dependiente de la experiencia del microscopista.

El suero o FCE canino diluido se incuba en los pocillos  individuales de un portaobjeto que contiene una mezcla de células (fibroblastos) infectadas con antígenos de CDV, junto a células no infectadas.

Luego se agrega un conjugado que contiene anticuerpos anti-IgM o anti-IgG marcados con fluoresceina, los cuales se unen al complejo Ag-Ac previanente  formado.

El resultado de la reacción se visualiza en un microscopio de fluorescencia en que la reacción positiva se aprecia con la emisión fluorescente color verde manzana desde la superficie de las células infectadas.

Los resultados positivos pueden ser re-testeados con diluciones mayores, para determinar el título reactivo máximo de la muestra.

Para revisar el diagnóstico de distemper mediante el método inmunoenzimático, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA).

IMMUNOCOMB

Es un método rápido, de baja complejidad  y niveles intermedios de sensibilidad y especificidad para la determinación de anticuerpos anti-CDV en sangre y FCE

Es un ensayo inmunoenzimático indirecto. La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas:

Punto superior — inmunoglobulina canina (Control Interno).

Punto inferior — antígeno estructural de CDV

La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo, pasando el peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa.

La reacción coloreada positiva en la fase sólida puede cuantificarse, comparando la intensidad del color de la reacción en una escala cromática incluida en el kit (Comb Scale) e interpolando en el gráfico adjunto para estimar los títulos de anticuerpos anti-CDV.

Para revisar la virología del virus distemper, pinche aquí.

VIROLOGÍA DEL VIRUS DISTEMPER CDV

El Distemper canino es causado por un Morbillivirus perteneciente a la familia Paramyxo-viridae estructuralmente relacionado con el virus Sarampión .

El virus tiene una envoltura de RNA en una cadena de polaridad negativa y se considera un serotipo único, con cepas que varían en su tropismo y virulencia.

La  secuencia de sus genes (hemaglutinina, neuraminidasa, proteína de fusión), sugieren que existen diferencias en los genotipos, condición que es de importancia para el diagnóstico molecular y para la elaboración de vacunas.

El virus se une a los receptores de la superficie celular de la célula huésped a través de la glicoproteína H (hemaglutinina).

Se fusiona con la membrana plasmática y el RNA de la cápside, para liberarse posteriormente en el citoplasma.

La replicación se inicia cuando la nucleoproteína está en cantidad suficiente para la neo-sintetisis de antigenomas y genomas virales.

El  RNA de la cápside interactúa con la proteína de la matriz debajo de la membrana plasmática y de las yemas para la posterior liberación del virión.

Para revisar  el diagnóstico molecular del distemper, pinche aquí.

DISTEMPER. DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR RT-PCR

Los métodos antes revisados para el diagnóstico ante-mortem de distemper  son altamente dependientes del estadío de la infección, de la condición clínica del paciente y no siempre cumplen con los requerimientos de sensibilidad y especificidad.

Los recientes desarrollos de las técnicas de biología molecular revelan la utilidad de estos métodos con propósitos diagnósticos, como también para estudios patológicos y epidemiológicos.

La Reación de la Plolimerasa en Cadena por transcripción reversa (RT-PCR) para la detección del RNA viral del CDV representa un método diagnóstico antemortem, altamente sensible y específico, temprano y seguro, utilizando muestras de sangre, suero y fluído cerebroespinal, independiente de los hallazgos clínicos, histopatológicos; de los títulos de anticuerpos  y de la distribución del antígeno viral, en casos agudos y crónicos.

La RT-PCR como prueba diagnóstica es capaz de amplificar fragmentos del ácidos nucleicos en forma exponencial, aún encontrándose en la muestra una sola molécula, indetectable por otros métodos, logrando determinar la infección desde el segundo día de iniciada.

Generalmente se amplifican fragmentos del gen que codifica la nucleoproteina (NP), una región conservada dentro del genoma viral. Además, puede aplicarse al estudio de variaciones genéticas del virus, mediante caracterización molecular de secuencias claves del genoma.

Este virus también ha sido detectado en la sangre de los cachorros clínicamente normales hasta 10 días después de la vacunación con vacunas de virus atenuados, por lo que se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados de estos pacientes.

La sensibilidad del método depende de la muestra utilizada, de la técnica de recogida, del estadio de la enfermedad, del método de extracción de ácidos nucleicos, de los cebadores (partidores o primers) y del método de PCR. Se mejora aún más la sensibilidad analítica si se utiliza la capa leucocitaria para la extracción de RNA.

DIAGNOSTICO DE DISTEMPER POR RT-PCR. DISEÑO DE PRIMERS

Un primer (partidor, cebador, iniciador), es una cadena de ácido nucleico que sirve como punto de partida para la replicación del DNA.

Es una secuencia corta que contiene un grupo 3'hidroxilo libre, que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra.

La secuencia y posición de los nucleótidos que conforman el primer se relaciona directamente con la especificidad del fragmento de DNA que se intenta replicar.

Se necesitan dos primers para la reacción de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra y se componen de aproximadamente 20 nucleótidos.

FUENTE:  J Clin Microbiol. 1999 November; 37(11): 3634–3643.
Copyright © 1999, American Society for Microbiology
Detection of Canine Distemper Virus Nucleoprotein RNA by Reverse Transcription-PCR Using Serum, Whole Blood, and Cerebrospinal Fluid from Dogs with Distemper.

DIEGNÓSTICO DE DISTEMPER POR RT-PCR. EXTRACCIÓN DEL RNA

El mRNA purificado de la muestra es utilizado posteriormente para la síntesis de la primera cadena de cDNA mediante Transcripción Reversa. En este proceso intevienen el RNA aislado (molde), la enzima Transcriptasa Reversa (de leucemia murina), cebadores de DNA, RNAasa, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y buffers.
El primer 1 se une a la cadena de RNA, y mediante la actividad de la Transcriptasa Reversa se extiende una cadena cDNA, resultando una molécula híbrida. A continuación, mediante la actividad de la enzima RNAasa H, se degrada el RNA viral que fué utilizado como molde.
El primer 2 se une al cDNA monocatenario para sintetizar la hebra complementaria y se procede a la correspondiente elongación mediante la actividad de la DNA polimerasa.
La amplificación del DNA que se ha sintetizado, se consigue mezclándolo con los primers de complentaridad específica al extremo 3´ del DNA, los cuales actuan como iniciadores para la actividad de la polimerasa. En esta solución deben también estar presentes los dNTPs que son las unidades que componene el DNA, en una mezcla equimolar, y la TAq polimerada (enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus).
Esta síntesis exponencial de DNA por RT-PCR incluye 3 pasos:

• Desnaturalización o separación de las hebras del DNA (94°C x 1,0 min)
• Alineamiento o apareamiento de los primers a la región complementaria del DNA (59,5°C x 2,0 min).
• Extensión o síntesis del nuevo DNA idéntico, mediante la actividad de la polimerasa (72°C x 1,0 min).

Estos pasos se repiten automáticamente unas 40 veces en un termociclador, para crear millones de copias del fragmento del DNA, derivado de la transcipción del RNA del virus distemper.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. RT-PCR ELECTROFORESIS

• El resultado del DNA amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, previamente cargado con muestras y controles, bajo un campo eléctrico de 60v durante 15 min. El gel luego es teñido con Bromuro de Etidio y se observa y fotografía en un visualizador de electroforetograma.
• Los canales electroforéticos son cargados con un control negativo (muestra libre de DNA), un control positivo (muestra con antígeno viral confirmado), marcadores de peso molecular y los productos PCR de cada muestra analizada. El resultado de esta PCR convencional es expresado en forma cualitativa (positivo o negativo).
• Está previamente definido que el DNA transcrito del RNA del CCV migra a una distancia equivalente a 287 pb. Confirmación que se hace por comparación con el marcador de peso molecular desplegado en el elecroforetograma.