Saturday, November 17, 2012

QUÍMICA SANGUÍNEA EN AVES Y REPTILES


 
 
 
Química Sanguínea en Vertebrados Menores (Aves y Reptiles)
T. W. Campbell

Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine & Biomedical Sciences, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA.

Traducido por Alejandro Flores A.
VetLab 

Introducción.

Los perfiles bioquímicos sanguíneos son recursos de laboratorio clínico  frecuentemente  utilizados para evaluar el estado fisiológico de los vertebrados menores (VM), como los peces, anfibios reptiles y aves. Sin embargo, existe  un déficit general de estudios controlados para aclarar el significado de las variaciones en la bioquímica sanguínea de estos animales en comparación con los mamíferos domésticos. Por lo tanto, los análisis bioquímicos de los VM no ha alcanzado el mismo grado de evaluación crítica que los mamíferos domésticos, aunque en la actualidad, las interpretaciones bioquímicas de la sangre son análogas entre ambos grupos,  con la consideración que los factores externos, como las condiciones ambientales tienen una mayor influencia sobre la fisiología normal y la salud de los vertebrados ectotérmicos, comparados con los endotérmicos. La especie, la edad, el sexo, el estado nutricional, la estacionalidad y el estado fisiológico influyen significativamente en la bioquímica sanguínea de los VM, especialmente en las especies ectotérmicas [1-3]. Esto hace más difícil  la interpretación de los resultados de la bioquímica sanguínea, cuyos valores normales  de referencia han sido reportados para algunas de estas especies, aunque las condiciones ambientales y los parámetros fisiológicos tales como el estado nutricional, el género y la edad generalmente no se han tenido en cuenta para establecer estos intervalos de referencia. Los  métodos de toma de muestras, la manipulación y los métodos de análisis, son fuentes adicionales de variación en los valores de referencia publicados. Por lo tanto, estos valores se utilizan generalmente como una guía amplia de interpretación de resultados bioquímicos sanguíneos en VM.

Debido a la dificultad en la obtención de intervalos de referencia representativos para las especies de VM atendidos práctica clínica, la mayoría de los médicos aplican ciertos niveles de decisión en su evaluación. Estos niveles de decisión abarcan el umbral por encima o por debajo del valor promedio determinado para un analito [generalmente +/- 2s], que le sugiera tomar una decisión clínica; optar por la repetición del análisis o por la indicación de pruebas complementarias antes del tratamiento. Los niveles de decisión se pueden definir mediante la utilización de los intervalos de referencia publicados, relacionándolos con los valores obtenidos por el laboratorio utilizado. Estos niveles de decisión pueden variar en cierto grado entre los clínicos, dependiendo de la experiencia y controles de calidad del laboratorio.

Los valores de referencia sugeridos en este texto son directrices generales que pueden ser utilizados como  niveles de decisión en la evaluación para ciertos  analitos en un perfil bioquímico de aves o reptiles.

El proceso de evaluación de los parámetros bioquímicos en sangre aves o reptiles puede ser optomizado mediante la determinación de un conjunto de valores para una especie. Muestreando un grupo homogéneo de individuos normales en cautiverio, mantenidos dentro de parámetros ambientales y nutricionales adecuados. Por lo tanto, cuando un individuo de este grupo se enferma, se dispone de un  conjunto de valores de referencia bioquímicos específicos y representativos para ese paciente.
Para acceder al texto completo pinche aquí.

Tuesday, November 06, 2012

HEMATOLOGÍA EN AVES Y REPTILES

 
Hematología en Vertebrados Menores (Aves y Reptiles). 
T. W. Campbell
Department of Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine & Biomedical Sciences, Colorado State University, Fort Collins, CO, USA. 2005.
Traducido por Alejandro Flores A. VetLab®
 
Introducción. 
La correcta evaluación del hemograma de cualquier paciente animal implica la determinación del recuento total de eritrocitos, hematocrito, concentración de hemoglobina, recuento absoluto y diferencial de leucocitos y la evaluación de un frotis teñido de sangre periférica. Las técnicas básicas utilizadas en la hematología de mamíferos también son aplicables a la de los vertebrados menores (VM), como las aves y los reptiles. Sin embargo, debido a que los VM tienen eritrocitos y trombocito nucleados y la morfología de sus células hemáticas es diferente a las de los mamíferos, hay ciertas modificaciones en las técnicas hematológicas. La evaluación del frotis de sangre periférica implica el examen morfológico y cualitativo de los componentes celulares de la muestra de sangre. Cada grupo celular [eritrocitos, leucocitos y trombocitos] debe ser evaluado por sus variaciones anormales.
Evaluación de los Eritrocitos.
El recuento de total de eritrocitos se puede obtener mediante un método manual estándar. El volumen aglomerado de células rojas se determina utilizando el método de microhematocrito, con centrifugación a 12.000g durante 5 minutos. La concentración de hemoglobina se determina mediante el método cianometahemoglobina en el sobrenadante después de la lisis eritrocitaria y de la eliminación de los núcleos libres por centrifugación. Los valores de las constantes eritrocitarias [VCM, CHCM y HCM] se pueden calcular mediante las fórmulas hematológicas convencionales una vez obtenidos el recuento de eritrocitos, el hematocrito y la concentración de hemoglobina.
El eritrocito aviar maduro normal es una célula oval con un núcleo oval en posición central.  El citoplasma se tiñe de naranja-rosa con la tinción de Wright y debiera tener una textura homogénea. El núcleo de los eritrocitos presenta una cromatina uniformemente condensada, la que se intensifica con la edad. Los eritrocitos maduros de los reptiles son generalmente más grandes que los eritrocitos de las aves. Son células elipsoidales con núcleos situados en posición central o excéntrica. Estos núcleos tienen a menudo márgenes irregulares. Los eritrocitos maduros de los peces y anfibios también son discos nucleados y elípticos. Los eritrocitos de anfibios son incluso más grandes que los de otros VM.
Los eritrocitos policromáticos se ven a menudo en los frotis de sangre periférica de aves normales. Por lo general, estas células representan menos del cinco por ciento de la población eritrocitaria. Este tipo de eritrocitos, así como los eritrocitos inmaduros, se presentan ocasionalmente en los frotis de sangre periférica de reptiles, anfibios y peces. Los eritrocitos inmaduros aumentan durante los períodos de ecdisis o muda y son más frecuentes en los reptiles jóvenes [1]. El grado de policromasia o reticulocitosis en reptiles normales es generalmente bajo y representa menos del uno por ciento de la población eritrocitaria. La razón puede ser que los reptiles tienen una tasa de recambio eritrocitario más lento en comparación con las aves y los mamíferos y su vida media que puede ser extenderse de 600 a 800 días en algunas especies [2,3].
El grado de policromasia es un buen indicador de la respuesta eritrocitaria regenerativa. Por ejemplo, las aves anémicas que muestran diez por ciento o más de policromasia [3+ ó 4+] presentan una adecuada respuesta regenerativa a la anemia. Los eritrocitos policromáticos tienen núcleos menos picnóticos que los eritrocitos maduros y tienen un citoplasma basófilo. En las aves, el grado de policromasia se puede evaluar basándose en el número promedio de eritrocitos policromáticos por campo monocapa en aumentos 1000X. Un grado ligero de policromasia [1+] se representa por 2 a 10 células policromáticas por campo monocapa 1000X; una policromasia leve [2+] por  11 a 14 células policromáticas por campo monocapa 1000X y una policromasia moderada [3+] y marcada [4 +] se representan por 15-30 y mayor de 30 eritrocitos policromáticos por campo monocapa 1000X, respectivamente.
Los reticulocitos aviares tienen una banda retícular que rodea el núcleo cuando se tiñen con colorantes supravitales, tales como nuevo azul de metileno [4,5].  Los recuentos de reticulocitos también se uilizan para evaluar la respuesta regenerativa de estos eritrocitos.
Las aves y otros vertebrados menores con anemias hipocrómicas suelen tener eritrocitos hipocrómicos o pálidos en los frotis de sangre periférica. Las enfermedades inflamatorias crónicas y la anemia por deficiencia de hierro a menudo presentan hipocromasia en las aves. El grado de hipocromasia se puede clasificar basándose en el número promedio de eritrocitos hipocrómicos por campo monocapa 1000X, donde un 1+, 2+, 3+ y 4 + de hipocromasia está representada por 1 a 2, 3 a 5, 6 a 10 y mayor que 10 células hipocrómicas, respectivamente.
Para revisar el texto competo pinche aquí.

Thursday, September 13, 2012

DIROFILARIA IMMITIS EN CHILE


Los hallazgos de microfilarias en frotis sanguíneos en este laboratorio, se han verificado en algunos pacientes caninos que provienen de países en donde esta parasitosis es endémica. No obstante, también fue diagnosticada mediante un hemograma solicitado a un canino callejero adoptado. Esta situación nos hace suponer que se trata de una enfermedad emergente en nuestro país, el que hasta la fecha ha sido considerado libre de dirofilariosis, siendo ésta de particular interés por su carácter zoonótico. Ante esto, consideramos relevante que los Médicos Veterinarios que atienden a carnívoros domésticos y de exhibición en los zoológicos, reconozcan los signos clínicos asociados a esta enfermedad; que la autoridad sanitaria disponga los sistemas de control para el ingreso al país de los animales hospedadores y difunda los protocolos de notificación epidemiológica para los casos confirmados. También es fundamental que los laboratorios clínicos veterinarios estandaricen los métodos de diagnóstico específico.




Se reproduce, a continuación, un resumen de la revisión bibliográfica publicada por la Dra. M. V. María Paz Muñoz Gajardo de la Universidad Austral de Chile. (Acceder al texto completo)



Dirofilaria immitis, es un nemátodo filaroídeo que provoca la “enfermedad del gusano del corazón”. Tiene una amplia distribución mundial, siendo endémica en todos los países de Sudamérica, excepto en Chile.

Es un nemátodo filiforme y cilíndrico, de color blanco, en sus formas adultas posee una cutícula con estriaciones transversales y longitudinales. Las hembras miden de 13,5 a 30 cm de largo y de 1 a 1,3 mm de diámetro. Los machos son de menor tamaño, miden 9,5 a 20 cm de largo, con 0,7 a 0,9 mm De diámetro. Su extremo posterior termina en espiral. Las microfilarias en promedio miden alrededor de 308μm de largo (con un rango de 295 a 325μm y 5 a 7,5μm de ancho, fusiformes, el extremo cefálico es ahusado y el extremo caudal puntiagudo y recto, no poseen vaina. Las microfilarias se encuentran todo el tiempo en la circulación periférica, pero para facilitar la transmisión, aumentan su concentración a la hora en que su vector se alimenta, a esta característica se llama periodicidad. Los mosquitos vectores pertenecen a la Familia Culicidae. Los culícidos son mosquitos pequeños, poco voluminosos y de patas largas (zancudos), vectores de la malaria, filarias y virus.

El principal hospedador definitivo y reservorio de la dirofilariosis, es el perro doméstico, pero también se incluyen cánidos salvajes como coyotes, lobos y zorros. Otros posibles huéspedes definitivos alternativos son el gato doméstico, mustélidos (hurones) y leones marinos de California, en los cuales hay desarrollo completo del parásito pero con una parasitación de baja intensidad y generalmente amicrofilarémica.

En algunos sectores de Chile, se dan las condiciones medioambientales y biológicas como para que se complete el ciclo de esta parasitosis y, por lo tanto, se puede considerar un país potencialmente en riesgo de infección. En los climas áridos del norte de Chile (I, II y III Región), se dan las condiciones de temperatura, pero no las de humedad. Sin embargo, las aguas estancadas en esas regiones semiáridas pueden permitir el desarrollo de las larvas de los mosquitos. En el norte chico (III, IV y V Región), la Región Metropolitana y la zona central (VI y VII Región) se dan las condiciones de temperatura y humedad durante gran parte del año o durante los meses de verano, lo que posibilitaría la sobrevivencia de vectores y el desarrollo del parásito.

A la fecha en Chile, no se han publicado trabajos sobre la existencia de un huésped intermediario que permita el desarrollo del parásito hasta su forma infectante. Sin embargo, el parásito podría adaptarse a los culícidos que sí están presentes, o eventualmente podría introducirse alguna de las setenta especies de mosquitos que actúan como hospedadores intermediarios y vectores biológicos de D. immitis.

Es de importancia que los Médicos Veterinarios chilenos tengan una mejor percepción de una parasitosis de índole mundial, que además es una zoonosis afortunadamente asintomática y, más aún, si existe la posibilidad que ingrese al país. Igualmente es trascendente que el profesional esté capacitado como para enfrentar una enfermedad emergente, saber controlarla y convertirla en un mal menor.

El diagnóstico de la infección en perros, se basa por lo general, en la identificación de microfilarias de D. immitis en una muestra de sangre o en la detección de antígenos del parásito adulto en sangre, suero o plasma, incluyendo siempre un examen físico.

La dirofilariosis podría sospecharse en perros de más de 2 años de edad que viven, o han vivido, en áreas endémicas, con alteraciones del aparato respiratorio como tos crónica, disnea de esfuerzo

o intolerancia al ejercicio, estertores, hemoptisis y alteraciones cardiovasculares como lipotimias o soplos cardiacos.

La identificación de microfilarias en sangre periférica, tiene una sensibilidad de 75% en animales que no están recibiendo tratamiento profiláctico con avermectinas.

Dentro de las técnicas de concentración habitualmente utilizadas para la detección de microfilarias se menciona la sedimentación mediante la técnica de Knott modificada y la filtración. Ambas técnicas de concentración son 50 a 90% más sensibles que el frotis sanguíneos directo. Sólo entre el 70 y el 80% de los perros infectados tienen microfilarias circulantes, por lo tanto, las pruebas de antígeno son muy superiores en la detección de parásitos adultos y son casi 100% específicos (es decir, prácticamente no hay ningún resultado falso positivo), por lo que deben utilizarse siempre como método screening de elección para la evaluación rutinaria.

Hematología: El hemograma es normal en la mayoría de perros con dirofilariosis clínica, puede presentarse un leucograma de estrés o una respuesta inflamatoria pronunciada, siendo habitual encontrar linfopenia entre leve y moderada. Las alteraciones hematológicas posibles de encontrar son:

• Anemia: alrededor de un 10% de los perros con dirofilariosis leve tiene anemia normocítica normocrómica. Entre el 50 y 60% de los perros con enfermedad grave presentan una ligera anemia no regenerativa normocítica hipocrómica, con un valor de hematocrito de 10 a 30%, excepto en animales con síndrome caval que presentan hemólisis. La vida media de los eritrocitos en perros asintomáticos es normal (25 días), pero se reduce a 15 días en perros con hipertensión pulmonar y a 11 días en animales con dirofilariosis grave.

• Eosinofilia: se encuentra en cerca del 85% de los perros con microfilarias circulantes y en el 95% de los perros amicrofilarémicos, debido a la destrucción de las microfilarias por la respuesta inmune.

• Basofilia: la dirofilariosis es la causa más habitual de basofilia en regiones endémicas. La basofilia junto con eosinofilia es un elemento sugerente aunque inespecífico de la enfermedad, pero en el 50% de los casos hay eosinofilia sin basofilia.

• Neutrofilia: generalmente hay aumento de la concentración de segmentados y monocitos y los recuentos plaquetarios decaen, en especial después del tratamiento adulticida. Los casos de leucocitosis son consecuencia del aumento de materiales extraños derivados de la fagocitosis de las filarias muertas y de las infecciones establecidas a nivel pulmonar, principalmente en las áreas lesionadas por tromboembolismo.

Perfil de coagulación: se altera significativamente en casos de tromboembolización grave, hay consumo activo de las plaquetas, fibrinógeno y otros substratos de la coagulación, pero la trombocitopenia relativa que se puede generar durante la enfermedad, se relaciona con el hecho que las plaquetas se adhieren a las superficies subendotelial lesionadas.

Bioquímica sanguínea: La concentración sérica de albúmina suele ser normal. La presencia de hipoalbuminemia es una situación crítica, ya que puede ser indicio de una glomerulopatía seria (amiloidosis o enfermedad por inmunocomplejos) indicativa de un daño renal progresivo irreversible, insuficiencia hepática grave o pérdida enterohepática de proteínas. Las complicaciones hepáticas y renales derivadas de la dirofilariosis pueden ser evaluadas con los perfiles bioquímicos respectivos.

Friday, August 17, 2012

TOXICOLOGIA VETERINARIA


El diagnóstico antemortem de las enfermedades toxicológicas, sobre la base de signos clínicos solamente a menudo es complejo y hasta peligroso. Cada sistema del organismo puede reaccionar de distinta forma, produciendo signos clínicos diversos frente a innumerables agentes tóxicos que pueden afectar a estos sistemas.
La enfermedades toxicológicas puede ser agudas o crónicas, y la presentación clínica variará dependiendo de la especie, de la vía involucrada, del agente y su magnitud; de la frecuencia de la exposición y del tiempo transcurrido desde esta exposición. Un diagnóstico toxicológico confirmado a menudo se basa en las conclusiones clínicas apropiadas. Entre ellas:
  • La historia de la exposición,
  • Los signos clínicos,
  • El tiempo de inicio,
  • La duración de los efectos en relación con el potencial tóxico del agente implicado,
  • La sustancia tóxica confirmada en el animal (por ejemplo, plomo en sangre),
  • La evidencia específica del trastorno fisiopatológico (por ejemplo, inhibición de la acetilcolinesterasa).
Incluso cuando un animal ya no puede beneficiarse de la confirmación positiva o negativa de laboratorio, esta información permite proteger a otros animales o a los seres humanos de las sustancias tóxicas evidenciadas.
Muchos antídotos específicos tienen una toxicidad inherente, y su uso a veces puede ser peligroso. Las 5 rutas básicas de la exposición a la intoxicación son:

1) la ingestión,
2) la absorción cutánea o tópica,
3) la inhalación, 4) la inyección o envenenamiento y
5) la absorción ocular.

La mayoría de las intoxicaciones resultan de la ingestión oral de una sustancia tóxica, pero algunos productos químicos incluyendo insecticidas, fenoles y otras sustancias lipofílicas, también pueden ser bien absorbidas a través la piel intacta. La piel erosionada puede absorber algunas sustancias que de otro modo podrían no llegar a concentraciones tóxicas después de la exposición dérmica. Por supuesto que muchos agentes con partículas volátiles, aerosoles, o incluso compuestos sólidos pueden ser absorbidos por el tracto respiratorio. Para la mayoría de los agentes, la velocidad de absorción de mayor a menor es:
  • Inyectable,
  • Respiratorio,
  • Oral,
  • Tópico.

El recorrido de la exposición a menudo influye en la elección de muestras para la confirmación. Además, de la toxicosis sistémica debido a la absorción sistémica de un agente, muchos otros compuestos corrosivos pueden dañar directamente el tejido. Los protocolos de toma de muestras toxicológicas en animales deben cosiderar los cuidados para evitar la contaminación cruzada de cualquier muestra de una potencial sustancia tóxica. Se recomienda obtener las muestras de los animales sospechosos antes de la manipulación del material de origen. Si es posible, antes de comenzar el tratamiento se deben obtener las muestras de sangre total con anticoagulante EDTA y luego congelar el plasma separado. Las muestras de vómitos, orina y heces son de gran utilidad para los análisis de laboratorio. Si no es posible recoger vómito, el lavado gástrico con agua es adecuado para el análisis. Los lavados o vómitos deben ser congelados en un frasco herméticamente cerrado. Si se sospecha de una exposición tópica, las muestras de pelo pueden ser congeladas en un recipiente químicamente limpio y sellado para el análisis.

Para el diagnóstico post-mortem la necropsia es fundamental para obtener un conjunto completo de muestras para los análisis químicos, histopatológicos y microbiológicos (bacteriano, viral, parasitario). Muchos diagnósticos toxicológicos se basan no sólo en la demostración de los residuos de la sustancia tóxica, sino también en las lesiones compatibles o en la ausencia de pruebas de otras enfermedades que causen efectos clínicos similares. Las muestras para análisis deben ser individuales, congeladas, en bolsas dobles o frascos plásticos herméticos, con rotulación clara. Los especímenes deben ser recogidos de manera sistemática: contenido gástrico o rumen, contenido intestinal, heces, tejido cerebral, hígado sin vesícula biliar, riñones, grasa corporal y orina. En caso de intoxicación a través de la piel, debe evitarse el contacto de este tejido con los órganos internos para evitar la contaminación cruzada. Se recomienda el lavado repetido o el reemplazo del material y los guantes utilizados después que las muestras de piel han sido tomadas. Iguales precauciones son necesarias cuando se sospecha de altas concentraciones de sustancias tóxicas en el tracto gastrointestinal o en los órganos para los análisis.
Para revisión completa acerca de toxicología veterinaria ingrese a este sitio.

Saturday, August 11, 2012

DIAGNOSTICO DE DISTEMPER. HEMATOLOGÍA Y BIOQUIMICA.


Los exámenes hematológicos y bioquímicos son inespecíficos. Sólo tienen valor para el monitoreo y el  pronóstico de la enfermedad.

Suele observarse anemia normocítica -normocrómica y regenerativa, la que puede incrementarse con el curso de la enfermedad.

La linfopenia absoluta ocurre por necrosis del dejido linfoide. Es dependiente de la edad y condición clínica del paciente, así como de la virulencia de la cepa viral.

Trombocitopenia moderada. También es dependiente de la edad, de la condición clínica de paciente y del genotipo viral.

Monocitosis relativa o absoluta es el cambio más constante en el leucograma.

Puede observarse leucocitosis neutrófila con o sin desviación a la izquierda, principalmente en cuadros con sobreinfección bacteriana.

Las proteínas totales generalmente son normales. Pueden aumentar en cuadros que cursan con deshidratación (↑ albúminas).

Las globulinas suelen estar aumentadas en pacientes inmunocompetentes.

En el FCE el diagnóstico puede hacerse si hay aumento de la proteinorraquia, pleocitosis linfocitaria, y son detectados anticuerpos específicos en una muestra no contaminada con sangre periférica.

Para revisar los métodos para diagnóstico de distemper mediante antígeno, pinche aquí.

Friday, August 10, 2012

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. DETECCIÓN DEL ANTIGENO VIRAL

La sensibilidad de estas pruebas es altamente dependiente de temporización del cuadro clínico.

Las partículas virales (antígenos) se pueden encontrar en los leucocitos, eritrocitos y células epiteliales tempranamente en el curso de la infección, a menudo antes de la aparición de los signos clínicos.

Luego de la aparición de estos signos, el antígeno CDV puede desaparecer de la sangre, conjuntiva y epitelio genital antes de una semana, detectándose por más tiempo en los macrófagos y en el epitelio del tracto respiratorio bajo.

La detección de antígenos virales de Distemper (acúmulos de cápsides intracitoplasmáticas) puede realizarse mediante métosdos serológicos o citológicos.


La Inmunocromatografía es un método similar a ELISA en su modalidad "sandwich". La reacción inunológica se realiza en una membrana cromatográfica por acción capilar. Se utilizan 2 tipos de anticuerpos contra el antígeno en estudio y uno para control positivo de la reacción.

Un anticuerpo está fijado en la membrana y el otro es un anticuepo marcado con oro coloidal infiltrado en la almoadilla que absorbe la muestra. Cuando la muestra líquida es colocada sobre esta almoadilla unida a la membrana, el antígeno de la muestra forma un inmunocomplejo con el anticuerpo marcado.
Este complejo migra en la fase líqida y se pone en contacto con el anticuerpo fijado en la membrana formando otro complejo que queda fijado en la membrana, formando una línea de color púrpura que denota la presencia del antígeno en una reacción positiva.
El excedente de antiecuerpos marcados con oro coloidal continua avanzando por capilaridad para unirse a los anticuerpos anti IgG fijados en el otro extremo de la membrana coloreándose como indicador de control de la reacción.

MICROSCOPÍA DE CUERPOS DE INCLUSIÓN CDV EN CÉLULAS SANGUÍNEAS Y CONJUNTIVALES.


Las inclusiones suelen ser fácilmente observadas enfrotis teñidos con Diff Quick.
La observación de la capa leucocitaria puede mejorar la probabilidad de encontrar estas células con inclusiones en sangre.
Dependiendo de los signos clínicos y de la etapa de la infección, las inclusiones intracitoplasmáticas se pueden encontrar en algunas células epiteliales de la conjuntiva, vejiga urinaria y en células del FCE.

Para revisar los métodos de diagnóstico mediante la determinación de anticuerpos pinche aquí.

Thursday, August 09, 2012

ANTICUERPOS ANTI DISTEMPER EN EL DIAGNÓSTICO.


El serodiagnostico, con determinación de anticuerpos IgM e IgG anti CDV, es el método diagnóstico más más solicitado al laboratorio. Si bien son pruebas confiables, es preciso una adecuada interpretación.
La medición de anticuerpos séricos IgM (contra las proteínas del núcleo viral NP y P) y los IgG (contra los antígenos de la cápsula H y F) ayudan al diagnóstico del Distemper, pero no es posible discriminar los anticuerpos pasivos maternos, los anticuerpos vacunales y los anticuerpos por infecciones subclínicas, de los que son producto de la enfermedad en cachorros, en animales previamente inmunizados o que han tenido contacto previamente con el virus.
Los de tipo IgM puede ser detectados en perros infectados no vacunados, entre los 6 y 8 días post infección. Los IgG aparecen entre los 10 y 20 días.
La pruebas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA, para la detección de IgM específica contra CDV, son pruebas útiles para el diagnóstico, ya que IgM persiste en perros infectados 1 a3 meses, dependiendo de la cepa viral y de la respuesta del huésped.
En perros vacunados la IgM persiste por unas 3-4 semanas. Falsos negativos pueden observarse en perros que mueren en forma aguda, sin la presencia de respuesta inmunitaria, y puede darse además, en presentaciones subagudas o crónicas.
Los títulos seriados de IgG determinados en 2 muestras con 2 semanas de diferencia, son de valor en perros que no han sido vacunados dentro del mes anterior. Un aumento de cuatro veces o mas, entre la etapa de la fase aguda y la convaleciente, es señal de una enfermedad activa.
Los títulos de anticuerpos en muestras de FCE, mayores que los del suero, se atribuyen a una infección activa, puesto que esos anticuerpos se han producido localmente.

Para revisar el método de inmunofluorescencia indirecta (IFA) para diagnosticar distemper, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER POR INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFA).

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFA).




Es un método de alta sensibilidad, especificidad  y valor diagnóstico, aunque su calidad es dependiente de la experiencia del microscopista.
El suero o FCE canino diluido se incuba en los pocillos  individuales de un portaobjeto que contiene una mezcla de células (fibroblastos) infectadas con antígenos de CDV, junto a células no infectadas.
Luego se agrega un conjugado que contiene anticuerpos anti-IgM o anti-IgG marcados con fluoresceina, los cuales se unen al complejo Ag-Ac previanente  formado.
El resultado de la reacción se visualiza en un microscopio de fluorescencia en que la reacción positiva se aprecia con la emisión fluorescente color verde manzana desde la superficie de las células infectadas.
Los resultados positivos pueden ser re-testeados con diluciones mayores, para determinar el título reactivo máximo de la muestra.

Para revisar el diagnóstico de distemper mediante el método inmunoenzimático, pinche aquí.

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. MÉTODO INMUNOENZIMÁTICO (ELISA).

IMMUNOCOMB

Es un método rápido, de baja complejidad  y niveles intermedios de sensibilidad y especificidad para la determinación de anticuerpos anti-CDV en sangre y FCE
Es un ensayo inmunoenzimático indirecto. La fase sólida es un peine con 12 proyecciones ("dientes"). Cada diente está sensibilizado en dos áreas reactivas:

Punto superior — inmunoglobulina canina (Control Interno).
Punto inferior — antígeno estructural de CDV
La Bandeja de Desarrollo tiene 6 filas (A-F) de 12 pocillos cada una. Cada fila contiene una solución reactiva lista para ser usada en cada etapa del ensayo, pasando el peine de una fila a otra, con un período de incubación en cada etapa.

La reacción coloreada positiva en la fase sólida puede cuantificarse, comparando la intensidad del color de la reacción en una escala cromática incluida en el kit (Comb Scale) e interpolando en el gráfico adjunto para estimar los títulos de anticuerpos anti-CDV.

Para revisar la virología del virus distemper, pinche aquí.

VIROLOGÍA DEL VIRUS DISTEMPER CDV

El Distemper canino es causado por un Morbillivirus perteneciente a la familia Paramyxo-viridae estructuralmente relacionado con el virus Sarampión .
El virus tiene una envoltura de RNA en una cadena de polaridad negativa y se considera un serotipo único, con cepas que varían en su tropismo y virulencia.
La  secuencia de sus genes (hemaglutinina, neuraminidasa, proteína de fusión), sugieren que existen diferencias en los genotipos, condición que es de importancia para el diagnóstico molecular y para la elaboración de vacunas.

El virus se une a los receptores de la superficie celular de la célula huésped a través de la glicoproteína H (hemaglutinina).
Se fusiona con la membrana plasmática y el RNA de la cápside, para liberarse posteriormente en el citoplasma.

La replicación se inicia cuando la nucleoproteína está en cantidad suficiente para la neo-sintetisis de antigenomas y genomas virales.
El  RNA de la cápside interactúa con la proteína de la matriz debajo de la membrana plasmática y de las yemas para la posterior liberación del virión.

Para revisar  el diagnóstico molecular del distemper, pinche aquí.

DISTEMPER. DIAGNÓSTICO MOLECULAR POR RT-PCR



Los métodos antes revisados para el diagnóstico ante-mortem de distemper  son altamente dependientes del estadío de la infección, de la condición clínica del paciente y no siempre cumplen con los requerimientos de sensibilidad y especificidad.

Los recientes desarrollos de las técnicas de biología molecular revelan la utilidad de estos métodos con propósitos diagnósticos, como también para estudios patológicos y epidemiológicos.

La Reación de la Plolimerasa en Cadena por transcripción reversa (RT-PCR) para la detección del RNA viral del CDV representa un método diagnóstico antemortem, altamente sensible y específico, temprano y seguro, utilizando muestras de sangre, suero y fluído cerebroespinal, independiente de los hallazgos clínicos, histopatológicos; de los títulos de anticuerpos  y de la distribución del antígeno viral, en casos agudos y crónicos.

La RT-PCR como prueba diagnóstica es capaz de amplificar fragmentos del ácidos nucleicos en forma exponencial, aún encontrándose en la muestra una sola molécula, indetectable por otros métodos, logrando determinar la infección desde el segundo día de iniciada.

Generalmente se amplifican fragmentos del gen que codifica la nucleoproteina (NP), una región conservada dentro del genoma viral. Además, puede aplicarse al estudio de variaciones genéticas del virus, mediante caracterización molecular de secuencias claves del genoma.

Este virus también ha sido detectado en la sangre de los cachorros clínicamente normales hasta 10 días después de la vacunación con vacunas de virus atenuados, por lo que se debe tener cuidado en la interpretación de los resultados de estos pacientes.

La sensibilidad del método depende de la muestra utilizada, de la técnica de recogida, del estadio de la enfermedad, del método de extracción de ácidos nucleicos, de los cebadores (partidores o primers) y del método de PCR. Se mejora aún más la sensibilidad analítica si se utiliza la capa leucocitaria para la extracción de RNA.

Wednesday, August 08, 2012

DIAGNOSTICO DE DISTEMPER POR RT-PCR. DISEÑO DE PRIMERS

Un primer (partidor, cebador, iniciador), es una cadena de ácido nucleico que sirve como punto de partida para la replicación del DNA.

Es una secuencia corta que contiene un grupo 3'hidroxilo libre, que forma pares de bases complementarios a una hebra molde y actúa como punto de inicio para la adición de nucleótidos con el fin de copiar la hebra.

La secuencia y posición de los nucleótidos que conforman el primer se relaciona directamente con la especificidad del fragmento de DNA que se intenta replicar.

Se necesitan dos primers para la reacción de PCR, uno en el extremo 3' y el otro complementario para la otra hebra y se componen de aproximadamente 20 nucleótidos.


FUENTE:  J Clin Microbiol. 1999 November; 37(11): 3634–3643.
Copyright © 1999, American Society for Microbiology
Detection of Canine Distemper Virus Nucleoprotein RNA by Reverse Transcription-PCR Using Serum, Whole Blood, and Cerebrospinal Fluid from Dogs with Distemper.

DIEGNÓSTICO DE DISTEMPER POR RT-PCR. EXTRACCIÓN DEL RNA


El mRNA purificado de la muestra es utilizado posteriormente para la síntesis de la primera cadena de cDNA mediante Transcripción Reversa. En este proceso intevienen el RNA aislado (molde), la enzima Transcriptasa Reversa (de leucemia murina), cebadores de DNA, RNAasa, desoxinucleótidos trifosfato (dNTP) y buffers.
El primer 1 se une a la cadena de RNA, y mediante la actividad de la Transcriptasa Reversa se extiende una cadena cDNA, resultando una molécula híbrida. A continuación, mediante la actividad de la enzima RNAasa H, se degrada el RNA viral que fué utilizado como molde.
El primer 2 se une al cDNA monocatenario para sintetizar la hebra complementaria y se procede a la correspondiente elongación mediante la actividad de la DNA polimerasa.
La amplificación del DNA que se ha sintetizado, se consigue mezclándolo con los primers de complentaridad específica al extremo 3´ del DNA, los cuales actuan como iniciadores para la actividad de la polimerasa. En esta solución deben también estar presentes los dNTPs que son las unidades que componene el DNA, en una mezcla equimolar, y la TAq polimerada (enzima termoestable aislada de la bacteria Thermus aquaticus).
Esta síntesis exponencial de DNA por RT-PCR incluye 3 pasos:
  • Desnaturalización o separación de las hebras del DNA (94°C x 1,0 min)
  • Alineamiento o apareamiento de los primers a la región complementaria del DNA (59,5°C x 2,0 min).
  • Extensión o síntesis del nuevo DNA idéntico, mediante la actividad de la polimerasa (72°C x 1,0 min).
Estos pasos se repiten automáticamente unas 40 veces en un termociclador, para crear millones de copias del fragmento del DNA, derivado de la transcipción del RNA del virus distemper.






Tuesday, August 07, 2012

DIAGNÓSTICO DE DISTEMPER. RT-PCR ELECTROFORESIS



  • El resultado del DNA amplificado se analiza mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,5%, previamente cargado con muestras y controles, bajo un campo eléctrico de 60v durante 15 min. El gel luego es teñido con Bromuro de Etidio y se observa y fotografía en un visualizador de electroforetograma.
  • Los canales electroforéticos son cargados con un control negativo (muestra libre de DNA), un control positivo (muestra con antígeno viral confirmado), marcadores de peso molecular y los productos PCR de cada muestra analizada. El resultado de esta PCR convencional es expresado en forma cualitativa (positivo o negativo).
  • Está previamente definido que el DNA transcrito del RNA del CCV migra a una distancia equivalente a 287 pb. Confirmación que se hace por comparación con el marcador de peso molecular desplegado en el elecroforetograma.